6 ОБМЕН БЕЛКОВ

---

 

6.1 Протеолиз

6.2 Распад аминокислот

6.3 Обезвреживание аммиака в организме. Синтез мочевины

6.4 Синтез аминокислот

6.5 Биосинтез белка

6.6 Регуляция синтеза белка

Нарушение обмена белков и аминокислот

---

В количественном отношении белки образуют самую важную группу макромолекул. В организме человека массой 70 кг содержится примерно 10 кг белка, причем большая его часть локализована в мышцах. По сравнению с белками доля других азотсодержащих веществ в организме незначительна. Поэтому баланс азота в организме определяется метаболизмом белков, который регулируется несколькими гормонами, прежде всего тестостероном и кортизолом.

В организме взрослого человека метаболизм азота в целом сбалансирован, т.е. количества поступающего и выделяемого белкового азота примерно равны. Если выделяется только часть вновь поступающего азота, баланс положителен. Это наблюдается, например, при росте организма. Отрицательный баланс встречается редко, главным образом как следствие заболеваний.

Полученные с пищей белки подвергаются полному гидролизу в желудочно-кишечном тракте до аминокислот, которые всасываются и кровотоком распределяются в организме (рисунок 58).

Восемь незаменимых аминокислот (валин, лейцин, изолейцин, треонин, лизин, метионин, фенилаланин, триптофан) не могут синтезироваться в организме человека и должны поступать с пищей. Еще две аминокислоты – аргинин и гистидин синтезируются в организме, но в недостаточном количестве, их нехватка также пополняется за счет пищи.

Все пищеварительные процессы являются гидролитическими, не окислительными, а значит, не приводят к большой потере энергии.

Распад белков до аминокислот происходит путем гидролиза – присоединяется H₂O по месту расщепления пептидных связей под действием протеолитических ферментов.

Каждые сутки в организм человека всасывается примерно 100 г аминокислот, которые поступают в кровь. Еще 400 г аминокислот поступает ежесуточно в кровь в результате распада собственных белков тела (протеолиз). Все эти 500 г аминокислот представляют собой метаболический запас. Из этого количества – 400 г используется для синтеза белков тела человека, а оставшиеся 100 г ежедневно распадаются до конечных продуктов: мочевины, CO₂ и воды. В процессе распада образуются также необходимые организму метаболиты, способные выполнять функции гормонов, медиаторов различных процессов и другие вещества (например: меланины, гормоны адреналин и тироксин).

Для белков мышц период полураспада составляет 80 дней, для белков плазмы крови – 14 дней, печени – 10 дней. Еще более короткоживущими являются ключевые ферменты промежуточного обмена. Они обновляются спустя несколько часов после синтеза. Это постоянное разрушение и ресинтез позволяет клеткам быстро приводить в соответствие с метаболическими потребностями уровень и активность наиболее важных ферментов. Особенно долговечными являются структурные белки, гистоны, гемоглобин или компоненты цитоскелета.

6.1 Протеолиз

Для полного расщепления белков до свободных аминокислот необходимо несколько ферментов с различной специфичностью: малоспецифичные протеиназы и высокоспецифичные протеиназы.

Пепсин. Это фермент желудочного сока. Синтезируется в клетках слизистой оболочки желудка в форме неактивного предшественника – пепсиногена. Превращение неактивного пепсиногена в активный пепсин происходит в полости желудка. При активации отщепляется пептид, закрывающий активный центр фермента. Активация пепсина происходит под действием двух факторов: соляной кислоты (HCl) и уже образовавшегося активного пепсина (автокатализ).

Пепсин гидролизует пептидные связи, образованные аминогруппами циклических аминокислот: фенилаланин, триптофан и тирозин. pH-оптимум пепсина равен 2,0–3,0, что соответствует рН желудочного сока.

Реннин. Этот фермент осуществляет переваривание казеина молока в желудочном соке грудных детей. Реннин похож по строению на пепсин, но его рН-оптимум соответствует рН среды желудка грудного ребенка (рН = 4,5). Реннин отличается от пепсина также механизмом и специфичностью действия.

Химотрипсин. Синтезируется в поджелудочной железе в форме неактивного предшественника – химотрипсиногена. Активируется путем аутокатализа. Разрушает пептидные связи, образованные карбоксильной группой тирозина (Тир), фенилаланина (Фен) или триптофана (Три), либо крупными гидрофобными радикалами лейцина (Лей), изолейцина (Иле) и валина (Вал) в том же положении.

В активном центре химотрипсина имеется гидрофобный карман, в который помещаются эти аминокислоты.

Трипсин. Синтезируется в поджелудочной железе в форме неактивного предшественника – трипсиногена. Активируется в полости кишечника ферментом энтеропептидазой при участии ионов кальция, а также способен к аутокатализу. Гидролизует связи, образованные положительно заряженными аминокислотами аргинином (Арг) и лизином (Лиз). Его адсорбционный центр схож с химотрипсином, но в глубине гидрофобного кармана есть отрицательно заряженная карбоксильная группа.

Эластаза. Синтезируется в поджелудочной железе в виде неактивного предшественника – проэластазы. Активируется в полости кишечника трипсином. Гидролизует пептидные связи, образованные глицином, аланином и серином.

Протеиназы и пептидазы имеются не только в желудочно-кишечном тракте, но и в клетках. По месту атаки молекулы субстрата протеолитические ферменты делятся на эндопептидазы и экзопептидазы. Эндопептидазы, или протеиназы, расщепляют пептидную связь внутри пептидной цепи. Они «узнают» и связывают короткие пептидные последовательности субстратов и относительно специфично гидролизуют связи между определенными аминокислотными остатками.

Протеиназы классифицируются по наличию в активном центре определенной аминокислоты и по механизму реакции. Сериновые протеиназы содержат в активном центре важный для каталитического действия этих ферментов остаток серина, в цистеиновых протеиназах таким является остаток цистеина и т.д. Экзопептидазы гидролизуют пептиды с конца цепи: аминопептидазы – с N-конца, карбоксипептидазы – с С-конца. Наконец, дипептидазы расщепляют только дипептиды.

Поскольку функциональные белки клетки должны быть защищены от преждевременного протеолиза, часть протеолитических ферментов клетки заключена в липосомы. Другая хорошо регулируемая система деградации белков локализована в цитоплазме. Она состоит из больших белковых комплексов (молекулярная масса 20106 Да) – протеасом. Белки, которым предстоит разрушение в протеасоме (например, содержащие ошибки транскрипции или состарившиеся молекулы), метятся путем ковалентного связывания с небольшим белком убиквитином. Меченые убиквитином («убиквитинированные») молекулы распознаются протеасомами, где и подвергаются деградации при участии энергии АТФ. Убиквитин не разрушается и после активации используется вновь.

Свободные аминокислоты, возникающие в результате гидролитического распада белков, используются в основном для ресинтеза белковых тел и лишь некоторая их часть подвергается дальнейшей деструкции. Кроме того, содержание свободных аминокислот в клетке постоянно пополняется за счет их синтеза de nоvо, охватывающего весь спектр протеиногенных аминокислот у автотрофов и заменимых аминокислот у гетеротрофов.

Для транспорта аминокислот как через внешнюю клеточную мембрану, так и через систему внутриклеточных мембран существуют специальные системы, работающие за счет энергии АТФ (активный транспорт) при посредничестве фермента γ-глутамилтрансферазы, а также при участии белков-переносчиков.

6.2 Распад аминокислот

Известны три типа превращений аминокислот в организме: по α-аминогруппе, карбоксильной группе и боковой группе.

Реакции по α-аминогруппе однотипны у всех аминокислот, это в основном реакции дезаминирования и переаминирования. Столь же однообразен набор химических процессов по карбоксильной группе аминокислот: это главным образом декарбоксилирование и образование аминоациладенилатов.

В отличие от первых двух типов превращений аминокислот преобразования в радикалах аминокислот исключительно разнообразны, многочисленны и, как правило, уникальны для каждой отдельной аминокислоты.

Превращение аминокислот по аминогруппе

Наиболее распространенной и важной реакцией аминокислот по α-аминогруппе является дезаминирование, которое заключается в отщеплении аминогруппы. Доказано существование 4 типов дезаминирования:

– восстановительное;

– гидролитическое;

– внутримолекулярное;

– окислительное.

1. Схема восстановительного дезаминирования:

2. Схема гидролитического дезаминирования:

3. Схема внутримолекулярного дезаминирования:

4. Схема окислительного дезаминирования:

Таким образом, помимо аммиака, продуктами дезаминирования являются жирные кислоты, гидрокси- и оксокислоты.

Для животных тканей, растений и большинства аэробных микроорганизмов преобладающим типом реакций является окислительное дезаминирование аминокислот, за исключением гистидина, подвергающегося внутримолекулярному дезаминированию.

Рассмотрим более подробно механизм окислительного дезаминирования аминокислот, протекающего в две стадии:

Первая стадия является ферментативной и завершается образованием неустойчивого промежуточного продукта (иминокислота), который на второй стадии спонтанно без участия фермента, но в присутствии воды распадается на аммиак и α-оксокислоту. Следует указать, что оксидазы аминокислот (L- и D-изомеров) являются сложными флавопротеинами, содержащими в качестве кофермента ФМН или ФАД, которые выполняют в этой реакции роль акцепторов двух электронов и протонов, отщепляющихся от аминокислоты. Оксидазы L-аминокислот могут содержать как ФМН, так и ФАД, а оксидазы D-аминокислот – только ФАД в качестве простетической группы.

Восстановленные флавиннуклеотиды оксидаз L- и D-аминокислот могут непосредственно окисляться молекулярным кислородом. При этом образуется перекись водорода, которая подвергается расщеплению под действием каталазы на воду и кислород:

Е―ФАДН₂ + О<₂→ Е―ФАД + Н₂О₂; Н₂О₂ → Н₂О + ¹/₂О₂

Впервые в лаборатории Д. Грина из ткани печени и почек крыс была выделена оксидаза, катализирующая дезаминирование 12 природных (L-изомеров) аминокислот. Оказалось, однако, что этот фермент имеет оптимум действия в щелочной среде (рН 10,0) и при физиологических значениях рН его активность на порядок ниже, чем при рН 10,0. В тканях животных и человека отсутствует подобная среда, поэтому оксидазе L-ами-нокислот принадлежит, вероятнее всего, ограниченная роль в процессе окислительного дезаминирования природных аминокислот. В животных тканях оксидазным путем со значительно большей скоростью дезами-нируются D-изомеры аминокислот. Не до конца ясным остается вопрос о том, каково значение столь активной оксидазы D-аминокислот в тканях, если поступающие с пищей белки и белки тела животных и человека состоят исключительно из природных (L-изомеров) аминокислот.

В животных тканях Г. Эйлером открыт высокоактивный при физиологических значениях рН специфический фермент – глутаматдегидрогеназа, катализирующий окислительное дезаминирование L-глутаминовой кислоты. Он является анаэробным ферментом и широко распространен во всех живых объектах. В качестве кофермента глутаматдегидрогеназа содержит НАД⁺ (или НАДФ⁺). Реакция включает анаэробную фазу дегидрирования глутаминовой кислоты с образованием промежуточного продукта – иминоглутаровой кислоты и спонтанный гидролиз последней на аммиак и α-оксоглутаровую кислоту (рисунок 59).

Первая стадия окисления глутаминовой кислоты аналогична реакции окислительного дезаминирования. Восстановленный НАДН (или НАДФН) далее окисляется при участии флавиновых ферментов и цитохромной системы (см. главу 1) с образованием воды как конечного продукта.

Глутаматдегидрогеназа животных тканей является одним из наиболее изученных ферментов азотистого обмена.

Помимо перечисленных 4 типов дезаминирования аминокислот и ферментов, катализирующих эти превращения, в животных тканях и печени человека открыты также три специфических фермента (серин- и треонин-дегидратазы, цистатионин-γ-лиаза), катализирующих неокислительное дезаминирование соответственно серина, треонина и цистеина.

Конечными продуктами реакций неокислительного дезаминирования серина, треонина и цистеина являются соответственно пируват и α-оксобутират, а также аммоний и сероводород:

Поскольку указанные ферменты требуют присутствия пиридоксальфосфата в качестве кофермента, реакция неокислительного дезаминирования, вероятнее всего, протекает с образованием шиффовых оснований как промежуточных метаболитов.

Шиффовы основания (азометины) – N-замещенные имины, характеризующиеся общей формулой R₁R₂C = NR₃, в которых азот связан с арильной или алкильной группой, но не с водородом.

Переаминирование

Под переаминированием подразумевают реакции межмолекулярного переноса аминогруппы (NH₂–) от аминокислоты на α-оксокислоту без промежуточного образования аммиака.

Впервые реакции переаминирования (трансаминирование) были открыты в 1937 г. советскими учеными А. Е. Браунштейном и М. Г. Крицман при изучении дезаминирования глутаминовой кислоты в мышечной ткани. При добавлении к гомогенату мышц глутаминовой и пировиноградной кислот образуются α-оксоглутаровая кислота и аланин без промежуточного свободного аммиака; добавление аланина и α-оксоглутаровой кислоты приводит к образованию соответственно пировиноградной и глутаминовой кислот.

Реакции переаминирования являются обратимыми и, как выяснилось позже, универсальными для всех живых организмов. Эти реакции протекают при участии специфических ферментов, названных А. Е. Браунштейном аминоферазами (по современной классификации, аминотрансферазы, или трансаминазы). Реакции переаминирования возможны между любой амино- и кетокислотой, однако наиболее интенсивно они протекают в том случае, когда один из партнеров представлен дикарбоновой амино- или кетокислотой. Донорами NН₂-группы могут также служить не только α-, но и β-, γ- и ω-аминогруппы ряда аминокислот.

Общую теорию механизма ферментативного переаминирования разработали А. Е. Браунштейн и М. М. Шемякин. Одновременно подобный механизм был предложен американскими биохимиками Э. Снеллом и Д. Метцлером. Все аминотрансферазы (как и декарбоксилазы аминокислот) – сложные ферменты, коферментом которых является пиридоксальфосфат. Специфичность аминотрансфераз обеспечивается белковым компонентом. Ферменты переаминирования катализируют перенос NH₂-группы не на α-оксокислоту, а сначала на кофермент пиридоксальфосфат. Образовавшееся промежуточное соединение (основание Шиффа) подвергается внутримолекулярным превращениям, приводящим к освобождению α-оксокислоты и пиридоксаминфосфата; последний на второй стадии реакции реагирует с любой другой α-оксокислотой, что через те же стадии образования промежуточных соединений (идущих в обратном направлении) приводит к синтезу новой аминокислоты и освобождению пиридоксальфосфата. Опуская промежуточные стадии образования шиффовых оснований, обе стадии реакции переаминирования можно представить в виде общей схемы:

В настоящее время экспериментально установлено, что практически все природные аминокислоты (исключение составляет метионин) сначала реагируют с α-оскоглутаровой кислотой в реакции переаминирования с образованием глутаминовой кислоты и соответствующей оксокислоты. Образовавшаяся глутаминовая кислота далее подвергается окислительному дезаминированию под действием глутаматдегидрогеназы.

Поскольку обе реакции (переаминирование и дезаминирование глу-таминовой кислоты) являются обратимыми, создаются условия для синтеза по существу любой аминокислоты, если в организме имеются соответствующие α-оксокислоты. Известно, что организм животных и человека не наделен способностью синтеза углеродных скелетов (α-оксокислот), так называемых незаменимых аминокислот; этой способностью обладают только растения и многие микроорганизмы.

Образовавшиеся в процессе дезаминирования и переаминирования α-оксокислоты подвергаются в тканях животных различным превращениям и могут вновь переаминироваться с образованием соответствующей аминокислоты. Открыты, кроме того, гликогенные, кетогенные и окислительные пути, ведущие к образованию соответственно глюкозы, жирных кислот, кетоновых тел и компонентов ЦТК.

Углеродные скелеты аминокислот могут включаться в ЦТК через ацетил-КоА, пируват, оксалоацетат, α-оксоглутарат и сукцинил-КоА. Пять аминокислот (Фен, Лиз, Лей, Трп, Тир) считаются «кетогенными», поскольку они являются предшественниками кетоновых тел, в частности ацетоуксусной кислоты, в то время как большинство других аминокислот, обозначаемых как «гликогенные», служат в организме источником углеводов, в частности глюкозы. Разделение аминокислот на «кетогенные» и «гликогенные» носит, однако, условный характер, поскольку отдельные участки углеродных атомов Лиз, Трп, Фен и Тир могут включаться и в молекулы предшественников глюкозы, например, Фен и Тир – в фумарат. Истинно «кетогенной» аминокислотой является только лейцин.

Эти процессы можно представить в виде общей сводной схемы:

Превращение аминокислот по карбоксильной группе

Процесс отщепления карбоксильной группы аминокислот в виде СО₂ получил название декарбоксилирования. Несмотря на ограниченный круг аминокислот и их производных, подвергающихся декарбоксилированию в животных тканях, образующиеся продукты реакции – биогенные амины – биологически активные соединения. В животных тканях установлено декарбоксилирование следующих аминокислот и их производных: тирозина, триптофана, 5-гидрокситриптофана, валина, серина, гистидина, глутаминовой и γ-гидроксиглутаминовой кислот, 3,4-дигидроксифенилаланина, цистеина, аргинина, орнитина, S-аденозилметионина и α-аминомалоновой кислоты. Помимо этого, у микроорганизмов и растений открыто декарбоксилирование ряда других аминокислот.

Для осуществления реакции декарбоксилирования аминокислота должна иметь свободную α-аминогруппу, свободную α-карбоксильную группу, а также удаленную от них полярную группу. Ферменты, катализирующие эти реакции – декарбоксилазы, эффективны лишь по отношению к L-изомерам соответствующей аминокислоты и поэтому могут быть использованы для получения D-изомера из их рацемата.

В живых организмах существует 4 типа декарбоксилирования аминокислот:

1. α-Декарбоксилирование. Характерно для тканей животных. В реакции участвует карбоксильная группа, связанная с α-углеродным атомом аминокислоты. Продуктами реакции являются СО₂ и биогенные амины:

R–CH(NH₃⁺)–COO^- → R–CH₂–NH₂ + CO₂

2. ω-Декарбоксилирование. Характерно для микроорганизмов. В реакции участвует карбоксильная группа, связанная с последним атомом углеродной цепи аминокислоты. Например, из аспарагиновой кислоты этим путем образуется α-аланин:

СОО^-–СН₂–CH(NH₃⁺)–COO^- → СН₃–CH(NH₃⁺)–COO^- + CO₂

3. Декарбоксилирование по типу переаминирования. В этой реакции образуются альдегид и новая аминокислота, соответствующая исходной кетокислоте.

4. Декарбоксилирование за счет конденсации двух кислот, одна из которых обязательно активирована КоА:

Эта реакция в тканях животных осуществляется при синтезе δ-амино-левулиновой кислоты из глицина и сукцинил-КоА и при синтезе сфинголипидов, а также у растений при синтезе биотина.

Реакции декарбоксилирования в отличие от других процессов промежуточного обмена аминокислот являются необратимыми. Декарбоксилазы аминокислот отличаются от декарбоксилаз α-оксокислот как белковым компонентом, так и природой кофермента (пиридоксальфосфатом). Таким образом, в двух совершенно различных процессах обмена аминокислот участвует один и тот же кофермент.

Одним из хорошо изученных ферментов является декарбоксилаза ароматических аминокислот. Она не обладает строгой субстратной специфичностью и катализирует декарбоксилирование L-изомеров триптофана, 5-гидрокситриптофана и 3,4-дигидроксифенилаланина; продуктами реакций, помимо СО₂, являются соответственно триптамин, серотонин и дигидроксифенилэтиламин (дофамин).

Образующийся в результате декарбоксилирования 5-гидрокси-триптофана – серотонин, является высокоактивным биогенным амином сосудосуживающего действия и регулирует артериальное давление, температуру тела, дыхание, почечную фильтрацию, а также является медиатором нервных процессов в ЦНС. Некоторые авторы считают серотонин причастным к развитию аллергии, демпинг-синдрома, токсикоза беременных и др.

Продукт декарбоксилазной реакции – дофамин является предшественником катехоламинов (норадреналина и адреналина). 3,4-дигидроксифенилаланин в организме образуется из тирозина при участии специфической тирозин-3-монооксигеназы, которая содержится в надпочечниках, тканях мозга и периферической нервной системы. Физиологическая роль тирозин-3-монооксигеназы чрезвычайно велика, поскольку катализируемая этим ферментом реакция определяет скорость биосинтеза катехоламинов, регулирующих деятельность сердечно-сосудистой системы.

В животных тканях с высокой скоростью протекает декарбоксилирование гистидина под действием специфической гистидиндекарбоксилазы.

Гистамин оказывает широкий спектр биологического действия. По механизму действия на кровеносные сосуды он резко отличается от других биогенных аминов, т.к. обладает сосудорасширяющим свойством. Большое количество гистамина образуется в области воспаления, что имеет определенный биологический смысл. Вызывая расширение сосудов в очаге воспаления, гистамин тем самым ускоряет приток лейкоцитов, способствуя активации защитных сил организма. Кроме того, гистамин участвует в секреции соляной кислоты в желудке, что широко используется в клинической диагностике (гистаминовая проба). Несмотря на то, что болевой синдром – сложный процесс, детали которого пока до конца не выяснены, гистамин участвует в нем как медиатор боли.

Еще один биогенный амин – этаноламин (2-аминоэтанол, тривиальное название коламин) образуется при декарбоксилировании серина и является исходным веществом для образования холина и его производных, а также является одним из компонентов фосфолипидов.

Изучены реакции α-декарбоксилирования дикарбоновых аминокислот, при этом из глутаминовой кислоты образуется γ-аминомасляная кислота, а из аспарагиновой – β-аланин.

Гамма-аминомасляная кислота накапливается в мозговой ткани и представляет собой нейрогуморальный ингибитор; β-аланин принимает участие в синтезе пантотеновой кислоты, которая, в свою очередь, является витамином.

Декарбоксилирование лизина и аргинина сопровождается образованием кадаверина (1,5-диаминопентан, пентаметилендиамин) и агматина:

В последнее время важное значение придают путресцину (1,4-ди-аминобутан, тетраметилендиамин), возникающему при декарбоксилировании аминокислоты – орнитина. В тканях организма путресцин – исходное соединение для синтеза двух физиологически активных полиаминов – спермидина и спермина. Эти вещества наряду с путресцином, кадаверином и другими диаминами входят в состав рибосом, участвуя в поддержании их структуры.

Ранее кадаверин и путресцин относили к так называемым трупным ядам (птомаинам), однако ядовитость их относительно невелика. Кадаверин обнаружен также и у растений.

Учитывая, что биогенные амины являются фармакологически активными веществами, некоторые из них применяются в качестве лекарственных препаратов.

Накопление биогенных аминов может отрицательно сказываться на физиологическом статусе и вызывать ряд существенных нарушений функций в организме. Однако органы и ткани, как и целостный организм, располагают специальными механизмами обезвреживания биогенных аминов, которые в общем виде сводятся к окислительному дезаминированию этих аминов с образованием соответствующих альдегидов и освобождением аммиака:

R–CH₂–NH₂ + H₂O + O₂ → R–CHО + NH₃ + H₂O₂

Ферменты, катализирующие эти реакции, называют моноамин- и диаминоксидазы.

Альдегиды далее окисляются до карбоновых кислот при участии альдегиддегидрогеназ и воды:

R–CОН + H₂O + НАД⁺ → R–CООH + HАДН + H⁺

Превращение аминокислот по боковой группе

Напомним, прежде всего, что радикалом аминокислоты принято называть ту часть ее молекулы, которая не принимает участия в формировании полипептидного остова. По своей химической природе радикалы аминокислот исключительно разнообразны, что служит материальной основой для многообразия присущих им химических реакций. Естественно, что многие из этих реакций осуществляются в процессе обмена аминокислот.

Важнейшим типом превращений аминокислот, протекающих с видоизменением радикалов, является переход одних аминокислот в другие. Благодаря этому в организме значительно усиливаются возможности для синтеза аминокислот.

Окисление. При окислении фенилаланина при участии фенилаланин-4-гидроксилазы образуется тирозин:

Окислительно-восстановительные процессы легко протекают по серосодержащим радикалам цистеина и цистина, благодаря чему эти две аминокислоты переходят друг в друга; химизм этой реакции аналогичен окислению глутатиона, а ускоряется она цистеинредуктазой.

Гидролиз. При гидролизе аргинина образуется аминокислота – орнитин, при декарбоксилировании которой, как уже отмечалось ранее, образуется биологически активный амин – путресцин. При окислении орнитина образуется глутаминовая кислота, а при циклизации и восстановлении – аминокислота пролин.

Изомеризация. Например, лейцин легко изомеризуется в изолейцин, и наоборот, при участии соответствующей изомеразы.

Декарбоксилирование в боковой группе аминокислоты. Характерно для моноаминодикарбоновых кислот. При этом образуются моноаминомонокарбоновые α-аминокислоты:

6.3 Обезвреживание аммиака в организме. Синтез мочевины

В организме человека подвергается распаду около 70 г аминокислот в сутки, при этом в результате реакций дезаминирования и окисления биогенных аминов освобождается большое количество аммиака, являющегося высокотоксичным соединением. Поэтому концентрация аммиака в организме должна сохраняться на низком уровне, который в норме в крови не должен превышать 60 мкмоль/л (это почти в 100 раз меньше концентрации глюкозы в крови). В опытах на кроликах показано, что концентрация аммиака 3 ммоль/л является летальной.

Таким образом, аммиак должен подвергаться связыванию в тканях с образованием нетоксичных соединений, легко выделяющихся с мочой.

Таким связующим веществом может служить белок, богатый аспарагиновой и глютаминовой кислотами. Аммиак связывается их радикалами с образованием соответственно аспарагина и глутамина:

Один из путей связывания и обезвреживания аммиака в организме, в частности в мозге, сетчатке, почках, печени и мышцах, – это биосинтез глутамина (и, возможно, аспарагина). Механизм этой синтетазной реакции, подробно изученный А. Майстером, включает ряд стадий. Синтез глутамина в присутствии глутаминсинтетазы может быть представлен:

Глу + Еnz + АТФ → Еnz–АДФ–Глу + Н₃РО₄

Еnz–АДФ–Глу + NH₃ → Глн + Еnz–АДФ

Еnz–АДФ → Еnz + АДФ

Глу + АТФ + NH₃ → Глн + АДФ + Н₃РО₄

Биосинтез аспарагина протекает несколько отлично и зависит от природы ферментов и донора аммиака. Так, у микроорганизмов и в животных тканях открыта специфическая аммиакзависимая аспарагинсинтетаза, которая катализирует синтез аспарагина в две стадии:

Асп + Еnz + АТФ → Еnz– аспартил~АМФ + Н₄Р₂О₇

Еnz– аспартил~АМФ + NH₃ → Асн + Еnz + АМФ

Асп + АТФ + NH₃ → Асн + АМФ + Н₄Р₂О₇

Глутамин и аспарагин выделяются с мочой в небольшом количестве. Было высказано предположение, что они выполняют скорее транспортную функцию переноса аммиака в нетоксичной форме.

Глутамин, кроме того, используется почками в качестве резервного источника аммиака (образуется из глутамина под действием глутаминазы), необходимого для нейтрализации кислых продуктов обмена при ацидозе и защищающего, тем самым, организм от потери с мочой ионов Na⁺.

Орнитиновый цикл образования мочевины

Основным механизмом обезвреживания аммиака в организме является биосинтез мочевины. Последняя выводится с мочой в качестве главного конечного продукта белкового, соответственно, аминокислотного обмена. На долю мочевины приходится до 80–85 % от всего азота мочи. Основным и, возможно, единственным местом синтеза мочевины является печень.

Впервые Г. Кребс и К. Гензеляйт в 1932 г. вывели уравнения реакций синтеза мочевины, которые представлены в виде цикла, получившего в литературе название орнитинового цикла. Следует указать, что в биохимии это была первая циклическая система метаболизма, описание которой почти на 5 лет опередило открытие Г. Кребсом другого метаболического процесса – цикла трикарбоновых кислот.

Весь цикл мочевинообразования может быть представлен следующим образом. На первом этапе синтезируется макроэргическое соединение карбамоилфосфат – метаболически активная форма аммиака, используемая в качестве исходного продукта для синтеза пиримидиновых нуклеотидов (а значит, ДНК и РНК) и аргинина (соответственно белка и мочевины):

К настоящему времени открыты три разных пути синтеза карбамоил-фосфата de novo, катализируемые тремя разными ферментами. Первую необратимую реакцию катализирует регуляторный фермент – аммиакзависимая карбамоилфосфатсинтетаза:

NH₃ + СО₂ + 2АТФ + Н₂О → NH₂–СО–О~РО₃^2- + 2АДФ + Н₃РО₄

Реакция требует затраты двух молекул АТФ, открыта в митохондриях клеток печени и используется преимущественно для синтеза аргинина и мочевины. В этой реакции в качестве активного стимулирующего аллостерического эффектора действует N-ацетилглутамат.

Вторую, также необратимую, реакцию катализирует глутаминзависимая карбамоилфосфатсинтетаза:

Глу-NH₂ + СО₂ + АТФ + Н₂О → NH₂–СО–О~РО₃^2- + АДФ + Глу

Данная реакция открыта в цитозоле клеток животных и требует наличия ионов Mg²⁺. Следует указать, что благодаря включению гидролитической стадии она используется преимущественно для синтеза пиримидиновых нуклеотидов. Фермент широко распространен в клетках животных.

Третью обратимую реакцию катализирует карбаматкиназа:

NH₃ + СО₂ + АТФ → NH₂–СО–О~РО₃^2- + АДФ

Реакция открыта у разных микроорганизмов и, возможно, используется скорее для ресинтеза АТФ, чем для синтеза карбамоилфосфата.

Последующие реакции цикла приведены на рисунке 60.

На втором этапе цикла мочевинообразования происходит конденсация карбамоилфосфата и орнитина с образованием цитруллина; реакцию катализирует орнитинкарбамоилтрансфераза.

На следующей стадии цитруллин превращается в аргинин в результате двух последовательно протекающих реакций. Первая из них – энергозави-симая. Это конденсация цитруллина и аспарагиновой кислоты с образованием аргининосукцината (эту реакцию катализирует аргининосукцинат-синтетаза). Аргининосукцинат распадается в следующей реакции на аргинин и фумарат при участии другого фермента – аргининосукцинатлиазы. На последнем этапе аргинин расщепляется на мочевину и орнитин под действием аргиназы.

Необходимо подчеркнуть, что аргиназа содержится в печени тех животных, которые экскретируют с мочой мочевину как основной и конечный продукт азотистого обмена. В печени птиц, например, аргиназа отсутствует, поскольку птицы вместо мочевины выделяют мочевую кислоту.

Суммарная реакция синтеза мочевины без учета всех промежуточных продуктов может быть представлена в следующем виде:

NH₃ + СО₂ + 3АТФ + 2Н₂О + Аспартат → Мочевина + 2АДФ + АМФ + Фумарат + 2 Н₃РО₄ + Н₄Р₂О₇

Реакция сопровождается снижением свободной энергии (ΔG₀ = –40 кДж), поэтому процесс всегда протекает в направлении синтеза мочевины. Следует указать, что синтез мочевины энергетически дорого обходится организму. На синтез одной молекулы мочевины требуется затрата четырех высокоэнергетических фосфатных групп: две молекулы АТФ расходуются на синтез карбамоилфосфата и одна – на образование аргининоянтарной кислоты, при этом АТФ расщепляется на АМФ и пирофосфат, который при гидролизе также образует две молекулы фосфорной кислоты.

Из приведенной схемы процесса мочевинообразования видно, что источником одиного из атомов азота мочевины является свободный аммиак (через карбамоилфосфат); второй атом азота поступает из аспартата. Аммиак образуется главным образом в процессе глутаматдегидрогеназной реакции.

Учитывая известные фактические данные о механизмах обезвреживания аммиака в организме, можно сделать следующее заключение. Часть аммиака используется на биосинтез аминокислот путем восстановительного аминирования α-оксокислот по механизму реакции переаминирования. Аммиак связывается при биосинтезе глутамина и аспарагина. Некоторое количество аммиака выводится с мочой в виде аммонийных солей.

Значительная часть азота аминокислот выделяется из организма в форме креатинина (C₄H₇N₃O), который образуется из креатина (азотсодержащая карбоновая кислота; участвует в энергетическом обмене в мышечных и нервных клетках позвоночных животных и человека) и креатинфосфата (продукт метаболического обратимого N-фосфорилирования креатина).

Наибольшее количество аммиака расходуется на синтез мочевины, которая выводится с мочой и потом в качестве главного конечного продукта белкового обмена в организме человека и животных. Подсчитано, что в состоянии азотистого равновесия организм взрослого здорового человека потребляет и соответственно выделяет примерно 15 г азота в сутки; из экскретируемого с мочой количества азота на долю мочевины приходится около 85 %, креатинина – около 5 %, аммонийных солей – 3 %, мочевой кислоты – 1 % и на другие формы – около 6 %.

В процессе эволюции живые организмы выработали различные типы азотистого обмена. Это аммониотелический тип, при котором главным конечным продуктом азотистого обмена является аммиак; он свойствен преимущественно рыбам. При уреотелическом типе обмена основным конечным продуктом обмена белков является мочевина; такой тип характерен для человека и животных. Урикотелический тип характерен для птиц и рептилий; главным конечным продуктом данного типа обмена является мочевая кислота.

Растения тоже образуют аммиак, который переводится в связанное состояние за счет белка, содержащего аспарагиновую и глутаминовую кислоты. Также в растительной клетке синтезируется мочевина в орнитиновом цикле.

6.4 Синтез аминокислот

Иногда в организме возникает ситуация, когда потребность в тех или иных аминокислотах больше, чем их поступает с пищей. Допустим, организму требуется 7 г аланина и 15 г глутамата, а с пищей поступило всего лишь 5 г аланина, но зато 20 г глутамата. Тогда организм, используя механизм переаминирования, может синтезировать недостающее количество аланина из пирувата, который синтезируется в больших количествах (сотни граммов в сутки). Таким образом, в организме постоянно происходит корректировка аминокислотного состава, но это не уменьшает потребности организма в пищевом белковом азоте.

Корректировка содержания заменимых аминокислот осуществляется с использованием непредельных карбоновых и α-кетокислот, образующихся в ходе метаболизма углеводов и жиров.

Существуют 3 пути синтеза аминокислот de novo:

– прямое аминирование непредельных карбоновых кислот;

– восстановительное аминирование;

– переаминирование.

Рассмотрим эти пути подробнее.

Прямое аминирование непредельных карбоновых кислот.Этот путь синтеза аминокислот не является основным, т.к. непредельных карбоновых кислот, из которых может быть осуществлен синтез, немного. Характерен в основном для бактерий и растений.

Восстановительное аминирование. Это главный путь новообразования аминокислот и является обратным процессом окислительного дезаминирования аминокислот. Субстратом аминирования выступают оксокислоты, процесс идет в 2 этапа:

Фермент восстановительного аминирования глутаминовой кислоты – глутаматдегидрогеназа – имеет в качестве кофермента пиридоксальфосфат.

В принципе, возможно восстановительное аминирование любой кетокислоты. Однако активность всех природных дегидрогеназ аминокислот, за исключением глутамат- и аланиндегидрогеназы, ничтожна, поэтому синтез всех остальных протеиногенных аминокислот путем восстановительного аминирования практического значения не имеет.

Таким образом, только аланин и глутаминовая кислота возникают за счет восстановительного аминирования из пировиноградной и α-оксо-глутаровой кислот, являющихся нормальными промежуточными продуктами распада углеводов и жирных кислот.

Механизм реакций переаминирования был рассмотрен ранее (п. 6.2). Этот путь обеспечивает синтез новых аминокислот из числа заменимых. Из заменимых аминокислот также могут образоваться необходимые клетке кетокислоты, что позволяет осуществлять корректировку аминокислотного состава клеток.

В основе этого лежит полная обратимость реакции переаминирования. Для характеристики направления каждой конкретной реакции переаминирования и определения положения равновесия с учетом закона действующих масс вычисляют константу равновесия (Кр):

Для большинства реакций переаминирования эта константа равновесия близка к единице:

тогда

При избытке какой-либо из кислот соотношение быстро восстанавливается трансаминазой за счет другой пары. Недостающее количество какой-либо из кислот может быть взято клеткой из других метаболических путей (например, из ЦТК). Избыток какой-либо из кислот может быть ликвидирован другими ферментами (например, избыточное количество глутамата окисляется глутаматдегидрогеназой).

Таким образом, в живом организме часть аминокислот образуется путем реакций прямого и восстановительного аминирования. Эти аминокислоты называют первичными:

– аспарагиновая кислота;

– глутаминовая кислота;

– аланин;

– серин.

Все остальные аминокислоты, которые образуются путем переаминирования с глутаминовой кислотой называют вторичными.

По путям биосинтеза аминокислоты делят на:

а) семейство аспартата: аспарагиновая кислота, аспарагин, изолейцин, метионин, лизин;

б) семейство глутамата: глутаминовая кислота, глутамин, аргинин, пролин;

в) семейство пирувата: аланин, валин, лейцин;

г) семейство серина: серин, цистеин, треонин, глицин;

д) семейство пентоз: гистидин, тирозин, триптофан, фенилаланин (т.е. все циклические аминокислоты).

Незаменимые аминокислоты не могут быть синтезированы в организме человека и животных, потому что в ходе распада углеводов и жиров не образуются соответствующие им α-оксокислоты. Проблема незаменимых аминокислот актуальна в питании человека, которому необходимо ежедневно получать с пищей 1 г L-триптофана, 2–3 г L-треонина, по 2–4 г L-лейцина, L-метионина и L-фенилаланина, 3–4 г L-изолейцина и 3–5 г L-лизина.

6.5 Биосинтез белка

Одной из глобальных задач современной биологии и ее новейших разделов – молекулярной биологии, биоорганической химии, физико-химической биологии – является выяснение молекулярных основ и тонких механизмов синтеза белка, содержащего сотни, а иногда и тысячи остатков L-аминокислот.

Механизм синтеза должен обладать весьма тонкой и точной кодирующей системой, которая автоматически программирует включение каждого аминокислотного остатка в определенное место полипептидной цепи. Установлено, что кодирующая система однозначно определяет первичную структуру, в то время как вторичная и третичная структуры белковой молекулы определяются физико-химическими свойствами и химической структурой радикалов аминокислот в полипептиде.

Ежедневно в организме человека ресинтезируется около 300–400 г белка. Первоначально представляли, что синтез белка могут катализировать те же протеолитические ферменты, которые вызывают и его гидролиз, но путем обратимости химической реакции. Однако оказалось, что синтетические и катаболические реакции протекают не только различными путями, но даже в разных субклеточных фракциях.

В настоящее время выяснены основные процессы, посредством которых осуществляется передача наследственной информации: репликация (синтез ДНК на ДНК-матрице), транскрипция (синтез РНК на ДНК матрице) и трансляция (англ. translation – перевод) – это биосинтез белка на матрице мРНК.

После переноса информации с ДНК на матричную РНК начинается синтез белков. Каждая зрелая мРНК несет информацию только об одной полипептидной цепи. Если клетке необходимы другие белки, то необходимо транскрибировать мРНК с иных участков ДНК. Отметим, что многие тонкие механизмы транскрипции и трансляции окончательно еще неясны.

В процессе трансляции только последовательность расположения нуклеотидов в мРНК определяет первичную структуру белка.

Белоксинтезирующая система включает как минимум 9 компонентов (таблица 3).

Активирование аминокислот

Необходимым условием синтеза белка является наличие в системе не свободных, а так называемых активированных аминокислот со своим внутренним запасом энергии. Активация свободных аминокислот осуществляется в присутствии АТФ и при помощи специфических ферментов – аминоацил-тРНК-синтетаз (сокращенно АРСаза).

Таблица 3 – Основные компоненты белоксинтезирующей системы

Необходимые компоненты	Функции
1. Аминокислоты	Субстраты для синтеза белков
2. тРНК	Обладают специфичностью к определенному ферменту и определенной аминокислоте. Должно быть минимум 20 разных видов тРНК. Акцепторным концом они взаимодействуют с аминокислотами, а антикодоном – с кодоном мРНК
3. Аминоацил-тРНК синтетазы	Каждая аа-тРНК-синтетаза катализирует реакцию специфического связывания одной из 20 аминокислот с соответствующей тРНК
4. мРНК	Матрица содержит линейную последовательность кодонов, определяющих первичную структуру белков
5. Рибосомы	4–12 рибосомы с присоединенной к ним мРНК составляют полирибосому, являющуюся местом синтеза белков
6. АТФ	Источник энергии
7. ГТФ	Принимает специфическое участие в стадиях инициации и элонгации синтеза белка в рибосомах
8. Белковые факторы	Специфические внерибосомные белки, необходимые для процесса трансляции
9. ионы Mg²⁺	В концентрации 0,005–0,008 М являются кофактором, стабилизирующим структуру рибосом

Экспериментально доказано существование в любых клетках живых организмов специфических ферментов, катализирующих активирование аминокислот и связывание последних с определенными тРНК. Все эти ферменты выделены в чистом виде из Е. coli, секвенированы, и для ряда их установлена трехмерная структура. Эти ферменты весьма чувствительны к реагентам на SH-группы и требуют присутствия ионов Mg²⁺.

Ферменты обладают абсолютной специфичностью действия, поскольку они узнают только одну какую-либо L-аминокислоту или одну тРНК. Для тех аминокислот, для которых открыты две и более тРНК, соответствующая АРСаза катализирует аминоацилирование всех этих тРНК.

Аминоацил-тРНК-синтетазы в последнее время стали делить на 2 класса в соответствии с различиями в их первичной и третичной структурах, а также в зависимости от своеобразия механизма катализируемой реакции. Первый класс включает ферменты, катализирующие синтез аминоацил-тРНК следующих аминокислот: Арг, Вал, Глн, Глу, Иле, Лей, Мет, Тир, Трп, Цис; второй класс – аминокислот Ала, Асн, Асп, Гис, Гли, Лиз, Про, Сер, Тре, Фен.

Считается, что в молекуле каждой аминоацил-тРНК-синтетазы имеется 3 центра связывания: для АТФ, аминокислоты и тРНК (рисунок 61).

Эти ферменты в активном центре содержат гистидин, имидазольное кольцо которого участвует в связывании АТФ посредством ионов Mg²⁺.

Активирование аминокислот происходит в 2 стадии.

На первой стадии аминокислота присоединяется к ферменту и реагирует с АТФ с образованием богатого энергией промежуточного соединения – аминоацил-АМФ (аминоациладенилат):

На второй стадии аминокислотный остаток аминоацил-АМФ, оставаясь связанным с ферментом, взаимодействует с молекулой соответствующей тРНК:

При этом образуется аминоацил-тРНК:

Суммарную реакцию, катализируемую аминоацил-тРНК-синтетазами в присутствии ионов Mg²⁺, можно выразить следующим образом:

Аминокислота +тРНК + АТФ → Аминоацил-тРНК + АМФ + Н₄Р₂О₇

Аминокислоты присоединяются к 3'- или 2'-ОН группам рибозы на 3'-конце тРНК, где все тРНК имеют общую нуклеотидную последовательность – АЦЦ.

Энергия, заключённая в макроэргической сложноэфирной связи аминоацил-тРНК, впоследствии используется на образование пептидной связи в ходе синтеза белка.

Пирофосфат, выделяющийся в ходе этой реакции, гидролитически расщепляется с образованием двух молекул ортофосфата и выделением энергии, что делает реакцию активации аминокислот необратимой.

Аминокислота, присоединяясь к тРНК, в дальнейшем не определяет специфических свойств аминоацил-тРНК, т.к. её структуру не узнаёт ни рибосома, ни мРНК. Участие в синтезе белка зависит только от структуры тРНК, а точнее, от комплементарного взаимодействия антикодона аминоацил-тРНК с кодоном мРНК.

Природа генетического кода

Необходимость кодирования структуры белков в линейной последовательности нуклеотидов мРНК и ДНК продиктована тем, что в ходе трансляции:

– нет соответствия между числом мономеров в матрице мРНК и продукте – синтезируемом белке;

– отсутствует структурное сходство между мономерами РНК и белка.

Это исключает комплементарное взаимодействие между матрицей и продуктом – принцип, по которому осуществляется построение новых молекул ДНК и РНК в ходе репликации и транскрипции.

Отсюда становится ясным, что должен существовать «словарь», позволяющий выяснить, какая последовательность нуклеотидов мРНК обеспечивает включение в белок аминокислот в заданной последовательности. Этот «словарь» получил название генетического, биологического, нуклеотидного или аминокислотного кода. Он позволяет шифровать аминокислоты, входящие в состав белков, с помощью определённой последовательности нуклеотидов в ДНК и мРНК.

Свойства генетического кода.

Триплетность. Кодирующими элементами в шифровании аминокислотной последовательности являются три последовательно расположенных нуклеотида, или триплет, которые получил название «кодон».

Специфичность. Каждому кодону соответствует только одна определённая аминокислота. В этом смысле генетический код строго однозначен.

Вырожденность. Их четырех азотистых оснований всего может быть построено 4³ = 64 триплета, в мРНК и ДНК 61 триплет смысловой, т.е. кодирует включение в белок одной из 20 аминокислот. Из этого следует, что в информационных молекулах включение в белок одной и той же аминокислоты определяют несколько кодонов. Это свойство биологического кода получило название вырожденности.

У человека одним кодоном зашифрованы только 2 аминокислоты – Мет и Три, тогда как Лей, Сер и Aрг – шестью кодонами, а Ала, Вал, Гли, Про, Тре – четырьмя кодонами (рисунок 62). Для многих аминокислот (валин, аланин, тирозин и др.) замена нуклеотида в третьей позиции кодона не сказывается на его смысле.

Линейность записи информации. В ходе трансляции кодоны мРНК «читаются» с фиксированной стартовой точки последовательно и не перекрываются. В записи информации отсутствуют сигналы, указывающие на конец одного кодона и на начало следующего.

Кодон АУГ является инициирующим и прочитывается как в начале, так и в других участках мРНК как метионин. Следующие за ним триплеты читаются последовательно без каких-либо пропусков вплоть до стоп-кодона, на котором синтез полипептидной цепи завершается.

Универсальность. До недавнего времени считалось, что код абсолютно универсален, т.е. смысл кодовых слов одинаков для всех изученных организмов: вирусов, бактерий, растений, земноводных, млекопитающих, включая человека. Однако позднее стало известно одно исключение, оказалось, что митохондриальная мРНК содержит 4 триплета, имеющих другое значение, чем в мРНК ядерного происхождения. Так, в мРНК митохондрий триплет УГА кодирует Три, АУА – Мет, а АЦА и AГГ прочитываются как дополнительные стоп-кодоны.

Колинеарность гена и продукта. У прокариотов обнаружено линейное соответствие последовательности кодонов гена и последовательности аминокислот в белковом продукте, или, как говорят, существует колинеарность гена и продукта.

Этапы синтеза белка

Синтез белка представляет собой циклический энергозависимый многоступенчатый процесс, в котором свободные аминокислоты полимеризуются в генетически детерминированную последовательность с образованием полипептидов.

В ходе синтеза белка прочтение информации мРНК идёт в направлении от 5'- к 3'-концу, обеспечивая синтез пептида от N- к С-концу.

Каждая эукариотическая мРНК кодирует строение только одной полипептидной цепи (т.е. она моноцистронна), в отличие от прокариотических мРНК, которые часто содержат информацию о нескольких пептидах (т.е. они полицистронны). Эти различия вызваны тем, что у прокариотов ДНК лишена интронов, и РНК-полимераза транскрибирует участки, прочтение информации с которых подчиняется общему регуляторному механизму, процессы транскрипции и трансляции не разделены. У эукариотов трансляция протекает в цитоплазме, куда из ядра поступают уже «зрелые» мРНК.

Этапы трансляции: инициация, элонгация и терминация.

Инициация. Сущность данной стадии – образование инициаторного комплекса.

Для инициации необходимы мРНК, ГТФ, малая и большая субъединицы рибосомы, белковые факторы инициации (IF и eIF), инициирующая аминоацил-тРНК (N-формилметионил-тРНК) и Mg²⁺.

В этом процессе у прокариот участвуют 3 белковых фактора инициации (IF-1, IF-2, IF-3) и не менее 10 факторов у эукариот (eIF – от англ. eukaryotic initiation factors, eIF-1, eIF-2, eIF-3, eIF-4A, eIF-4B, eIF-4C, eIF-4d, eIF-5, eIF-6).

У прокариот для того, чтобы обеспечить синтез белка в направлении NH₂ → СООН, необходима блокировка NН₂-группы метионина за счет альдегидной группы, при этом формируется N-формилметионин.

Эукариотическая клетка не нуждается в формилировании метионина.

На стадии инициации требуется разместить рибосому на 5'-конце мРНК и связать с инициирующим кодоном антикодон формилметионил-тРНК. Этот процесс включает следующие этапы (рисунок 63):

– 30S-субъединица рибосомы связывается с 2 факторами инициации IF-1 и IF-3. Фактор IF-3 препятствует объединению 30S- и 50S-субъединиц рибосом с образованием непродуктивного 70S-комплекса. К малой субъединице присоединяется мРНК.

– комплекс, состоящий из 30S-субъединицы, IF-3 и мРНК, связывается с комплексом ГТФ–IF-2 и инициирующей N-формилметионил-тРНК. Антикодон тРНК образует водородные связи с инициирующим кодоном мРНК.

В транслирующей рибосоме инициирующая N-формилметионил-тРНК связывается с первым кодоном АУГ мРНК и располагается в Р-центре (пептидил-тРНК-связывающий участок) большой субъединицы. А-центр (аминоацил-тРНК связывающий участок) остается свободным, он будет задействован на стадии элонгации для связывания аминоацил-тРНК (рисунок 63).

– образовавшийся комплекс взаимодействует с 50S-субъединицей рибосомы. Белковый фактор IF-2 способствует соединению малой и большой субъединиц рибосом. После присоединения большой субъединицы рибосомы происходит гидролиз ГТФ и высвобождение всех факторов инициации – IF-1, IF-2, IF-3. Полностью собранная рибосома содержит 3 функциональных участка, образованных благодаря специфическому сочетанию областей 30S- и 50S-субъединиц рибосом. Пептидильный участок (P-участок) имеет сродство к пептидам и содержит в процессе синтеза растущую полипептидную цепь. Аминоацильный участок (A-участок) содержит аминоацил-тРНК, соединенную с соответствующим кодоном мРНК. Е-участок является местом в 50S-субъединице, откуда тРНК покидают рибосому во время элонгации. Фактор инициации IF-1 связывается с A-участком и предотвращает присоединение к нему аминоацил-тРНК во время инициации синтеза полипептидной цепи (рисунок 63). N-формилметионин-тРНК является единственной аминоацил-тРНК, которая связывается с Р-участком; во время элонгации остальные аминоацил-тРНК связываются вначале с А-участком и затем переходят в P-участок и Е-участок. В результате стадии инициации синтеза полипептидной цепи образуется функциональная 70S-рибосома, которая называется инициаторным комплексом.

Элонгация полипептидной цепи. Необходимые компоненты для элонгации: инициаторный комплекс, образованный на стадии инициации; полный набор аминоацил-тРНК; белковые факторы элонгации (EF-Tu, EF-Ts, EF-G у бактерий, еEF1 и еEF2 у эукариот); ГТФ; Mg²⁺ и пептидилтрансфераза.

Включение каждой аминокислоты в белок происходит в 3 стадии, в ходе которых:

• аминоацил-тРНК каждой входящей в белок аминокислоты связывается с А-центром рибосомы;
• происходит образование пептидной связи между первой аминокислотой и последующей аминокислотой;
• удлинённая на один аминокислотный остаток пептидил-тРНК перемещается из А-центра в Р-центр в результате транслокации рибосомы.

1-й этап – связывание аминоацил-тРНК в А-центре (рисунок 64). Фактор элонгации EF-Tu образует комплекс с ГТФ, который связывается со всеми аминоацил-тРНК в цитоплазме. Тройной комплекс, аминоацил-тРНК–EF-Tu–ГТФ, по принципу комплементарности взаимодействует антикодоном с кодоном мРНК в A-участке рибосомы. Фактор элонгации EF-Tu обладает ГТФ-азной активностью. Молекула ГТФ гидролизуется и комплекс EF-Tu–ГДФ высвобождается из 70S рибосомы. Комплекс EF-Tu–ГТФ восстанавливается при помощи EF-Ts и ГТФ.

2 этап – образование пептидной связи (рисунок 65). Пептидная связь образуется между двумя аминокислотами, которые связаны с тРНК в А- и Р-участках рибосомы. Происходит перенос инициирующей N-формил-метионильной группы от тРНК на аминогруппу второй аминокислоты, находящейся в А-участке. α-Аминогруппа аминокислоты в A-участке действует как нуклеофильная группа, замещая тРНК в P-участке для образования пептидной связи. В результате образуется дипептидил-тРНК в А-участке, и деацилированная тРНК остается связанной с Р-участком. Образование пептидной связи катализируется ферментом пептидилтрансферазой (составная часть 50S субъединицы рибосомы).

3 этап – транслокация (рисунок 65). При участии фактора EF-G (транслоказа) и за счет энергии ГТФ происходит процесс транслокации – рибосома перемещается на один кодон мРНК в направлении 5ꞌ→3ꞌ, пептидил-тРНК перемещается в P-участок, а тРНК из P-участка перемещается в Е-участок, а затем освобождается в цитозоль.

В результате транслокации в А-участок рибосомы приходит следующий новый кодон мРНК. К нему методом случайного подбора присоединяется комплементарная аминоацил-тРНК. Между дипептидом P-участка и аминокислотным остатком в A-участке замыкается пептидная связь. Образующийся трипептид транслоцируется в Р-участок, а в A-участок приходит следующий новый кодон мРНК и т. д. Таким образом, процесс повторяется, пока в P-участок не придет один из терминирующих кодонов.

Элонгационный цикл у эукариот подобен циклу у прокариот. Факторы элонгации eEF1α, eEF1βγ и eEF2 выполняют функции, аналогичные функциям EF-Tu, EF-Ts, EF-G, соответственно. Эукариотические рибосомы не имеют Е-участка. Ненагруженная тРНК удаляется непосредственно из Р-участка.

Циклы элонгации повторяются столько раз, сколько аминокислот необходимо включить в полипептидную цепь. Скорость удлинение цепи у прокариот выше, чем у эукариот, и составляет около 20 аминокислот в секунду.

Терминация – последняя стадия трансляции (рисунок 66).

Синтез белка продолжается до тех пор, пока рибосома не достигнет на мРНК особых терминирующих кодонов – стоп-кодонов УАА, УАГ, УГА. Данные триплеты не кодируют ни одну из аминокислот, их также называют нонсенс-кодоны. При вхождении этих кодонов внутрь рибосомы происходит активация белковых факторов терминации (или релизинг факторов (от англ. releasing factor) – RF1, RF2, RF3 (у прокариот), которые последовательно катализируют:

−гидролитическое отщепление полипептида от конечной тРНК;

−отделение от Р-участка последней тРНК;

−диссоциацию рибосомы.

Источником энергии для завершения трансляции является ГТФ.

В норме отсутствуют молекулы тРНК, способные узнавать нонсенс-кодоны. Факторы терминации узнают данные кодоны: RF1 узнает кодоны УАА и УАГ, RF2 – УАА и УГА. У эукариот в терминации участвует фактор eRF, который узнает все три кодона терминации.

Связывание релизинг-фактора с терминирующим кодонам в A-участке активирует пептидилтрансферазу, которая гидролизует связь между полипептидом и тРНК в P-участке. После гидролиза и высвобождения синтезированного полипептида и тРНК рибосома диссоциирует на малую и большую субъединицы, готовых к синтезу новой полипептидной цепи.

Специфическая функция RF3 установлена неточно и предполагают, что он участвует в диссоциации рибосомы на субъединицы.

Таким образом, матричная природа процесса трансляции проявляется в том, что последовательность поступления аминоацил-тРНК в рибосому для синтеза белка строго детерминирована мРНК, т.е. порядок расположения кодонов вдоль цепи мРНК однозначно задаёт структуру синтезируемого белка. Рибосома сканирует цепь мРНК в виде триплетов и последовательно отбирает из окружающей среды «нужные» аминоацил-тРНК, освобождая в ходе элонгации деацилированные тРНК.

Малая и большая субъединицы рибосомы в процессе трансляции выполняют разные функции: малая субъединица присоединяет мРНК и декодирует информацию с помощью тРНК и механизма транслокации, а большая субъединица ответственна за образование пептидных связей.

Каждая рибосома занимает на мРНК участок длиной около 80 нуклеотидов, поэтому рибосомы располагаются на мРНК с интервалом примерно в 100 нуклеотидов. Чем длиннее полипептидная цепочка синтезируемого белка, тем больше рибосом может одновременно осуществлять синтез этого белка, значительно увеличивая, таким образом, эффективность использования матрицы и образуя полирибосому (рисунок 67).

Полирибосомы могут существовать в виде частиц, плавающих в цитоплазме клеток, или могут быть связаны с эндоплазматическим ретикулумом (ЭПР).

Свободные цитоплазматические полирибосомные частицы ответственны за синтез белков, выполняющих внутриклеточные функции. Полирибосомы, ассоциированные с ЭПР, под электронным микроскопом имеют вид «шероховатой» поверхности, и белки, ими синтезируемые, должны транспортироваться через мембрану.

Посттрансляционные модификации полипептидной цепи

После того как пептидная цепь отходит от рибосомы, она должна принять свою биологически активную форму, т.е. свернуться определенным образом, связать какие-либо группы и т.п. Реакции превращения полипептида в активный белок называются процессинг или посттрансляционная модификация белков. К реакциям процессинга относятся:

1. Удаление с N-конца метионина или даже нескольких аминокислот специфичными аминопептидазами.

2. Образование дисульфидных мостиков между остатками цистеина.

3. Частичный протеолиз – удаление части пептидной цепи, как в случае с инсулином или протеолитическими ферментами ЖКТ.

4. Присоединение химической группы к аминокислотным остаткам белковой цепи:

– фосфорной кислоты – например, фосфорилирование по аминокислотам серину, треонину, тирозину используется при регуляции активности ферментов или для связывания ионов кальция;

– карбоксильной группы – например, при участии витамина К происходит γ-карбоксилирование глутамата в составе протромбина;

– метильной группы – например, метилирование аргинина и лизина в составе гистонов используется для регуляции активности генома;

– гидроксильной группы – например, присоединение ОН-группы к лизину и пролину с образованием гидроксипролина и гидроксилизина необходимо для созревания молекул коллагена при участии витамина С;

– йода – например, в тиреоглобулине присоединение йода необходимо для образования предшественников тиреоидных гормонов йодтиронинов.

5. Включение простетической группы.

6. Объединение протомеров в единый олигомерный белок, например, гемоглобин, коллаген, лактатдегидрогеназа, креатинкиназа.

Процесс укладки вытянутой полипептидной цепи в правильную трехмерную пространственную структуру называют фолдинг белка.

Для обеспечения фолдинга используется группа вспомогательных белков под названием шапероны (chaperon от франц. – спутник, нянька). Они предотвращают взаимодействие новосинтезированных белков друг с другом, изолируют гидрофобные участки белков от цитоплазмы и правильно располагают белковые домены. В целом шапероны способствуют переходу структуры белков от первичного уровня до третичного и четвертичного.

6.6 Регуляция синтеза белка

В белковом синтезе не только количественный и качественный состав белков, но и время синтеза имеют большое значение. Клетки живых организмов обладают способностью синтезировать огромное количество разнообразных белков. Однако они никогда не синтезируют все белки. Синтез белка регулируется внешними и внутренними факторами и условиями, которые диктуют клетке синтез такого количества белка и такого набора белков, которые необходимы для выполнения физиологических функций. Все это свидетельствует о весьма сложном, тонком и целесообразном механизме регуляции синтеза белка в клетке.

Общую теорию регуляции синтеза белка разработали французские ученые, лауреаты Нобелевской премии Ф. Жакоб и Ж. Моно. Сущность этой теории сводится к «выключению» или «включению» генов как функционирующих единиц, к возможности или невозможности проявления их способности передавать закодированную в структурных генах ДНК генетическую информацию на синтез специфических белков. Явления – индукция и репрессия – взаимосвязаны.

Регуляция работы генов у прокариот

У прокариот участвуют по крайней мере 3 типа генов: структурные гены, ген-регулятор и ген-оператор.

Между структурными генами и промотором – посадочной площадкой для РНК-полимеразы есть особый участок ДНК – оператор. Он так называется потому, что именно с него начинается операция – синтез и-РНК. С оператором взаимодействует специальный белок-репрессор (подавитель). Пока белок-репрессор связан с оператором, РНК-полимераза не может сдвинуться с места и начать синтез и-РНК (рисунок 68).

Когда в клетке содержится индуктор, для расщепления которого нужны ферменты, закодированные в структурных генах, он связывается с белком-репрессором. В этом случае белок-репрессор теряет способность взаимодействовать с оператором. РНК-полимераза теперь беспрепятственно синтезирует иРНК, которая обеспечивает на рибосомах синтез ферментов, расщепляющих индуктор (рисунок 67).

Когда последние молекулы индуктора будут разрушены, белок-репрессор вновь заблокирует ген-оператор. Для каждого оперона имеется свой специфический индуктор. Например, для лактозного оперона индуктором является лактоза, для фруктозного – фруктоза.

Регуляция работы генов у эукариот

Эукариотические организмы (и особенно млекопитающие) устроены значительно сложнее прокариотов и нуждаются в более сложном аппарате регуляции. Так, в организме человека имеется более 200 различных типов клеток, существенно различающихся по структуре и функциям. В то же время различными методами исследования ДНК (прежде всего, методом молекулярной гибридизации) доказано, что количество и структура ДНК практически всех клеток организма одинаковы (за исключением лимфоцитов), т.е. все клетки организма содержат один и тот же геном. У высших организмов по сравнению с прокариотическими существенно возрастает содержание ДНК на гаплоидную клетку: с 4,2×10⁶ пар нуклеотидов у Е. coli до 3,3×10⁹ пар нуклеотидов в клетках человека.

Схема регуляции транскрипции разработана Г. П. Георгиевым (1972). Единица транскрипции у эукариот называется транскриптон, и он состоит из неинформативной (акцепторной) и информативной (структурной) зон (рисунок 69).

Неинформативная зона начинается промотором с инициатором, за которым расположена информативная зона. Информативная зона транскриптона образована структурными генами, содержащими интроны и экзоны. Заканчивается транскриптон терминатором.

Работу транскриптона регулирует несколько генов-регуляторов, несущих информацию о структуре нескольких белков-репрессоров. Индукторами в клетках эукариот являются сложные молекулы (например, гормоны), для расщепления которых требуется несколько ферментов (многоступенчатые реакции).

Когда индукторы освобождают гены-операторы от белков-репрессоров, РНК-полимераза разрывает водородные связи между комплеметарными цепочками ДНК участка (транскриптона). На этом участке начинает синтезироваться пре-мРНК. Далее в ядре клетки происходит сплайсинг и формируется моноцистронная мРНК, которая выходит в цитоплазму и служит матрицей для синтеза белка-фермента, необходимого для синтеза ферментов, расщепляющих индуктор. Включение и выключение транскриптона происходит принципиально так же, как и оперона прокариот.

6.7 Нарушение обмена белков и аминокислот

О нарушении обмена аминокислот в целостном организме судят не только по количественному и качественному составу продуктов их обмена в крови и моче, но и по уровню самих свободных аминокислот в биологических жидкостях организма. Большинство тканей характеризуется своеобразным аминокислотным «спектром». В плазме крови он примерно соответствует аминокислотному составу свободных аминокислот в органах и тканях, за исключением более низкого содержания глутамата и аспартата и более высокого уровня глутамина.

Специфические проявления недостаточности аминокислот могут развиваться у человека только в условиях патологии при повышенном использовании данной аминокислоты. Так, у больных с карциноидной опухолью более 60 % триптофана окисляется по серотониновому пути (в норме 1 %); это, естественно, приводит к относительной недостаточности указанной аминокислоты. У больных со злокачественной меланомой тирозин и, возможно, фенилаланин расходуются преимущественно на биосинтез меланина. В связи с возможностью приготовления искусственных рационов (исключение из рациона человека и животных какой-либо аминокислоты) можно описать синдром, характерный для недостаточности данной аминокислоты. Так, недостаток триптофана у человека ведет к уменьшению массы тела, а у новорожденного даже 10-дневный дефицит триптофана приводит к анорексии и гипопротеинемии. Недостаток лизина у человека вызывает головокружение, тошноту, повышенную чувствительность к шуму; недостаток гистидина сопровождается снижением концентрации гемоглобина. При недостаточности аргинина у крыс наблюдается атрофия семенников, а у человека – гипоспермия. Исключение из пищи метионина ведет к жировому перерождению печени и почек, обусловленному недостатком лабильных метильных групп, необходимых для синтеза фосфатидилхолинов.

Некоторые заменимые аминокислоты становятся незаменимыми, если они не поступают с пищей, т.к. клетки организма не справляются с быстрым их синтезом. По данным Р. Фишера, недостаток цистеина ведет к почти полному торможению роста in vitro даже при наличии всех остальных аминокислот в среде. Доказано, кроме того, что достаточное количество цистеина в пище значительно снижает потребность в метионине. Напротив, полное исключение цистеина из рациона может настолько резко повысить потребность в метионине, что обычно адекватное питание оказывается недостаточным. Таким образом, заменимые аминокислоты могут оказаться лимитирующими факторами анаболических процессов в организме.

Одно из характерных нарушений азотистого обмена – белковая недостаточность, являющаяся следствием не только дефицита белка, но и ряда тяжелых заболеваний даже при достаточном поступлении белка с пищей. Белковая недостаточность у человека развивается как при полном и частичном голодании, так и при приеме однообразного белкового питания, когда в диете преобладают белки растительного происхождения, биологическая ценность которых значительно ниже ценности белков животного происхождения. Результатом этих состояний являются развитие отрицательного азотистого баланса, гипопротеинемии (снижение концентрации белков в сыворотке крови до 50–30 г/л; в норме 65–85 г/л) и развитие отеков. При тяжелых формах пищевых дистрофий наблюдаются тяжелые поражения печени, остановка роста, резкое снижение сопротивляемости организма инфекциям, отечность, атония мышц. Болезнь часто заканчивается летальным исходом.

Количественному учету при белковой недостаточности в основном поддаются нарушения, связанные с обменом аминокислот. Одним из наиболее ранних нарушений азотистого обмена при белковой недостаточности является резкое снижение интенсивности процессов дезаминирования, переаминирования и биосинтеза аминокислот, а также синтеза мочевины в печени. Оказалось, что эти нарушения обусловлены недостаточным синтезом и разрушением белковой части ферментов, катализирующих эти реакции; исключение составляет аргиназа, активность которой при этом почти не нарушена.

При белковой недостаточности, помимо нарушений общих процессов аминокислотного обмена, отмечены специфические изменения обмена отдельных аминокислот. Так, нарушения обмена триптофана выражаются в снижении синтеза никотинамида. Нарушения в обмене гистидина сводятся к снижению активности гистидин-аммиак-лиазы и гистаминазы и, напротив, к повышению активности гистидиндекарбоксилазы. Все это способствует накоплению гистамина в тканях со всеми вытекающими отсюда отрицательными последствиями. При белковой недостаточности обмен метионина практически не нарушен.

Аминоацидурия. Качественный и количественный состав аминокислот мочи человека имеет прежде всего диагностическое значение, поскольку некоторые болезни человека возникают вследствие первичного нарушения обмена отдельной аминокислоты или группы аминокислот. Кроме того, для ряда органических поражений органов и тканей человека, а также аномалий обмена характерен свой аминокислотный спектр мочи. Ввиду этого, а также благодаря легкой доступности объекта исследования анализ мочи на наличие аминокислот приобретает большое клиническое значение. На экскрецию аминокислот большое влияние оказывают возраст, характер питания, пол, гормоны и другие факторы. Установлено, что у младенцев с мочой выделяется больше аминокислот, чем у взрослых. Обычно различают повышенную и пониженную экскрецию аминокислот. В свою очередь гипераминоацидурия делится на почечную, связанную с приобретенными или врожденными дефектами реабсорбции аминокислот в почках, и внепочечную, обусловленную увеличением концентрации всех или отдельных аминокислот в крови.

Как известно, обратное всасывание аминокислот (реабсорбция) в почках происходит против градиента концентрации; в своей основе этот процесс, вероятнее всего, является ферментативным, однако детально он пока не выяснен. При хронических нефритах часто с мочой выделяется больше лизина, аргинина, пролина и цитруллина, хотя их уровень в крови может оставаться в пределах нормы. При нефрозах почти всегда выделяется больше этаноламина, таурина и β-аминомасляной кислоты, и эта гипер-аминоацидурия считается неблагоприятным прогностическим признаком.

Значительно чаще встречаются наследственные дефекты всасывания аминокислот в почках.

Фенилкетонурия (фенилпировиноградная олигофрения) развивается как результат потери способности организма синтезировать фенилаланин-4-монооксигеназу, катализирующую превращение фенилаланина в тирозин. Характерные особенности болезни – резкое замедление умственного развития ребенка, а также экскреция с мочой больших количеств фенил-пировиноградной кислоты и фенилацетилглутамина. Решающим доказательством метаболического блока при фенил-кетонурии являются данные о накоплении фенилаланина в тканях. Развитие болезни можно предотвратить, если значительно снизить прием фенилаланина с пищей с самого рождения ребенка.

Альбинизм – врожденное отсутствие пигментов в коже, волосах и сетчатке. Метаболический дефект связан с потерей меланоцитами способности синтезировать тирозиназу – фермент, катализирующий окисление тирозина в диоксифенилаланин и диоксифенилаланинхинон, являющихся предшественниками меланина. Предположение о блокировании процесса полимеризации меланина при альбинизме не подтвердилось.

В ряде случаев вследствие блокирования действия какого-либо фермента имеет место резкое отставание умственного развития. Вопрос о том, чем обусловлено это торможение психической деятельности – токсическим действием ненормально высоких концентраций аминокислот или их метаболитов на мозг, нарушением нормального соотношения аминокислот и, следовательно, биосинтеза белка либо вторичными нарушениями энергетического и других видов обмена – окончательно не решен. Таким образом, идентификация химической реакции или ферментативной системы, нарушение функции которой является первопричиной развития тяжелого наследственного заболевания, в наши дни не только представляет большой теоретический интерес, но в ряде случаев играет решающую роль в диагностике и терапии этих болезней. Всегда следует учитывать, что при блокировании нормального пути обмена какой-либо аминокислоты промежуточные метаболиты, следующие за местом блокирования, становятся незаменимыми при данном заболевании.

---